Nat Cell Biol |突破瓶颈！何爱彬/程和平/肖文磊团队实现小鼠心脏发育全景实时纪录

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生命的诞生与发展，隐秘而伟大，我们尽力去获悉，试图去解读。然而，“只言片语”联想的发育起源，从“蛛丝马迹”中推断出的发展轨迹，使得我们对生命真相的认知充满争议。近年来，实时成像技术，尤其是光片显微镜技术的兴起和发展，”see is believing”，高清快速成像，实现了在单细胞水平上，对全细胞谱系进行连续的，长时间的追踪，从“祖先”开始，对“家族”扩大的动态过程进行完整记录，逐步揭开斑马鱼，果蝇【1-5】等模式生物的发育轨迹，也试图揭示哺乳动物胚胎发育的神秘【6】。然而，哺乳动物器官发育与形态发生的记录，仍是一个难以逾越的技术鸿沟。实时成像哺乳动物胚胎发育过程，建立单细胞分辨率的全细胞谱系历史，是发育生物学的难点和热点。其难点有三：1.哺乳动物胚胎体外培养难以模拟体内发育过程，更大挑战为如何保证适合连续实时成像的培养体系；2. 长时程连续成像不可避免的光毒性与光漂白性对胚胎发育的影响；3. 哺乳动物胚胎或器官成像深度和视场大，细胞异质性大，产生的海量图像数据（~2T/天）面临细胞识别与谱系追踪的难度远比透明的斑马鱼等大。心脏作为哺乳动物胚胎发育中第一个形成的功能性器官，是其他组织器官发育的关键，迫性地希望能够对心脏谱系进行长时程连续性动态追踪，描绘出形态发生的精确过程，阐明心脏起源和发育的细胞动力学机制。然而，心脏成像却面临更大的挑战——心跳使得难以获得单细胞分辨率的图像！

2020年3月2日，北京大学何爱彬团队联合程和平团队以及北京航空航天大学肖文磊副教授于Nature Cell Biology在线发表了题为“Long-term, in toto live imaging of cardiomyocyte behaviour during mouse ventricle chamber formation at single-cell resolution”的文章，以小鼠胚胎心脏为研究对象，首次突破了哺乳动物器官发育动态记录的这一障碍。实现了单细胞分辨率的，不间断的全细胞数字谱系，对哺乳动物器官发育进行实时追踪和还原，揭示了心脏发育过程从心管起源到心室建立，肌小梁形成的高精度细胞动力学新机制。

这项研究突破了上述一系列挑战，实现了对小鼠胚胎心脏进行单细胞的、长时程的、连续的全谱系追踪，解码了哺乳动物心室建成的细胞动力学机制，描绘出第一幅哺乳动物器官发育动态图谱。一方面实现了技术上的创新与整合，为科学研究提供了包含显微镜，胚胎培养，图像处理等在内的多种有效工具与解决方案；一方面更新了发育生物学上的认知与理解，探索了哺乳动物器官建成的关键细胞生物学过程，如心室膨大与肌小梁形成的机制。

“厉兵秣马”——建立多模块的光片显微镜成像系统

研究者自主开发了一套垂直式光片显微镜，命名为vertical light-sheet fluorescence microscope (vLSFM)，达到了约832 × 832 × 800 μm3大视场，0.45 μm的横向分辨率，和约2.5 μm的轴向分辨率，能够对小于10.5天的小鼠胚胎心脏进行单细胞级别的成像，是一套既满足研究目标，又考虑了便捷性与拓展性的光片显微镜。研究者巧妙地设计了一款V型中空琼脂柱，将几何思想融入到传统的琼脂柱样本固定方法中，为小鼠胚胎提供充足的发育空间与营养供给，同时使得样本在成像的过程中保持相对稳定的位置。此外，研究者设计了一套无菌的小鼠胚胎培养系统，提供稳定的温度和气体环境，保障小鼠胚胎心脏能够在体外进行正常的发育（图1）。更重要的是，研究者利用红外门控技术，实现了对小鼠胚胎跳动的心脏进行实时的，稳定的单细胞级别成像。基于此，研究者建立了包含显微镜，样本固定与培养，心跳同步在内的多模块成像系统，清除了小鼠胚胎心脏成像领域的多种障碍，并为哺乳动物器官成像提供了模块化的新工具，这些工具即可单独使用，又可整合联动，可供研究者选择性使用。

图1. 自主开发的垂直式光片显微镜系统

“利刃出鞘”——首次捕获小鼠胚胎心脏发育的长时程图像

创新性的工具探索与工程设计，为我们探索生命的神秘之处提供了新的可能。研究者利用上述一整套完备的光片显微镜成像系统，实现了对小鼠胚胎心脏进行长达数天的单细胞谱系动态追踪，获取了哺乳动物器官动态发育的首套数据库，拍摄到了心脏发育过程中的多个关键形态发生过程，涵盖了心脏从新月形发展到心管（视频1）以及整个心室建成的过程（视频2）。

视频1. 小鼠胚胎原始心脏心管的起源形成

视频2. 小鼠胚胎心脏心室发育过程

每次实验产生海量原始数据（~2T/天），对图像处理也提出了很高的要求。为此，与北京航空航天大学肖文磊副教授合作，自主开发了一套具有高适用性与延展性的图像预处理程序，极大地提高了图像识别和谱系追踪的准确率（99.68%），可以精准的跟踪到参与“心室建设”的每一个细胞单元和每一个谱系家族（视频3，视频4，注：由于微信限制，视频4可在相关网站观看）。

视频3. 准确追踪细胞轨迹

“剖玄析微”——哺乳动物心室建成的全景解读

假设心室建成是一个房屋搭建的过程，每一个细胞都是一块砖头，长时间的单细胞追踪能力，使得我们第一次，弄清楚了这些砖头如何排列整合，如何构成外部的轮廓（心室膨大过程），如何进行内部的陈设（肌小梁形成过程）。研究者发现，心室膨大通过心室最外层细胞的有方向迁移完成，并且可通过其他层细胞的插入和最外层细胞的水平分裂补充外壳空隙，从而建立一个完整的心室外部（图2）。此外，研究者利用简化的谱系树模型，追踪到了肌小梁细胞的两种起源方式：内层肌小梁细胞的自我增值式，和外层细胞的外部补充式，有序完成心室内部构建（图3）。这种单细胞级别的谱系追踪，全面地解析了心室建成的细胞学机制。

图2. 心室的外部搭建：膨大的机制

图3. 心室的内部陈设：肌小梁的起源与形成

该研究提供了一整套活体胚胎心脏成像系统解决方案，是哺乳动物发育生物学领域的一项重大突破与进展。在实时全谱系水平上解析器官发育过程的细胞行为轨迹与模型，可以揭示微妙的细胞动态异常，是揭示相关疾病发生和起源机制的新利器。

博士后招聘

何爱彬实验室常年招聘有发育生物学背景，对实时成像与器官发育和再生的全景谱系研究方向感兴趣的研究人员（近2年或即将取得博士学位）。请联系：[e-mail].

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41556-020-0475-2

参考文献

1. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J. & Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science 305, 1007-1009, doi:DOI 10.1126/science.1100035 (2004).

2. Mickoleit, M. et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nat Methods 11, 919-922, doi:10.1038/nmeth.3037 (2014).

3. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J. & Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science 322, 1065-1069, doi:10.1126/science.1162493 (2008).

4. Ichikawa, T. et al. Live imaging and quantitative analysis of gastrulation in mouse embryos using light-sheet microscopy and 3D tracking tools. Nat Protoc 9, 575-585, doi:10.1038/nprot.2014.035 (2014).

5. Amat, F. et al. Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data. Nat Methods 11, 951-958, doi:10.1038/nmeth.3036 (2014).

6. McDole, K. et al. In Toto Imaging and Reconstruction of Post-Implantation Mouse Development at the Single-Cell Level. Cell 175, 859-876 e833, doi:10.1016/j.cell.2018.09.031 (2018).